محلول B را خارج کرده و ژل را با آب مقطر شستشو می دهیم و با آب مقطر به مدت ۱ دقیقه روی شیکر قرار می دهیم تا نیترات نقره حذف گردد.
محلول C (20 میلی لیتر NaOH ، ۲۰۰ میکرولیتر فرمالدهید را با آب اتوکلاو به حجم ۱۰۰ میلی لیترمی رسانیم) را به ژل اضافه کرده و به آرامی تکان می دهیم، پس از گذشت مدت زمان کوتاهی باندها به آرامی بر روی ژل ظاهر می گردد.
قطعات دارای جهش، الگوی باندی متفاوتی نسبت به فرد طبیعی نشان می دهند که وجود یک تغییر نوکلئوتیدی نامعلوم را مشخص می گردد و به دنبال آن برای شناسایی دقیق این تغییرات نوکلئوتیدی ، نمونه ها را برای تعیین توالی به کشور کره جنوبی فرستاده شد.

فصل سوم:
نتایج
۳
پس از جمع آوری نمونه های خون افراد، ابتدا استخراج DNA براساس کیت بیان شده انجام گرفت، و پس از آن قطعۀ ۳۵۳bp با PCR در هر نمونه تکثیر شد.
۲
۴
۳
۱
ladder
← ۳۵۰
۲۵۰
←۲۵۰
شکل ۳-۱ : تصویری از الکتروفورز محصول PCR نمونه های مورد مطالعه بر روی ژل آگاروز
برای تشخیص جهش ها از تکنیک SSCP استفاده شد. قطعات دارای جهش، الگوی متفاوتی از باندها را نسبت به افراد نرمال دارند. که ایجاد یک تغییر نوکلئوتیدی را نشان داده، که برای شناسایی این تغییرات از تعیین توالی استفاده شد.
۱۰ ۹ ۸ ۷ ۹ ۵ ۴ ۳ ۲ ۱
شکل ۳-۲ : تصویری از آنالیز SSCP روی ژل پلی آکریل آمید
)نمونه های ۳ و۹ و ۱۰ دارای دو جهش ۴۳۶۰C>T و۴۵۴۳T>C هستند(
همان طور که در ژل SSCP می بینیم نمونه های ۳ و۹ و۱۰ دارای شیفت باندی هستند پس از چندین بار تکرار این نمونه ها برای تعیین توالی فرستاده شد.
ما در این مطالعه دو تغییر یافتیم. تغییر ۴۳۶۰C>T، اسید آمینه تروئونین که یک اسیدآمینه قطبی با اندازه متوسط است به اسید آمینه متیونین که یک اسیدآمینه با اندازه متوسط و هیدروفوب است تبدیل می گردد.
تغییر ۴۵۴۳T>C ، یک اسیدآمینه متیونین که یک اسیدآمینه، با اندازه متوسط و غیرقطبی است به اسیدآمینه توئونین که یک اسیدآمینه با اندازه متوسط و قطبی است تبدیل می گردد.
Homozygote TT
M207M
Homozygote CC
T207T

↑
C
↑
نمونه دارای جهش ۴۳۶۰C>T فرد سالم
شکل ۳-۳ : تشخیص جهش ۴۳۶۰C>T با بهره گرفتن از تکنیک SSCP و تعیین توالی
) گراف ها ، جانشینی T با C را نشان می دهد (.
Heterozygote CT
M268T
Homozygote TT
M268M

↑C
T
↑
نمونه دارای جهش۴۵۴۳T> C فرد سالم
شکل ۳-۴ : تشخیص جهش ۴۵۴۳T>C با بهره گرفتن از تکنیک SSCP و تعیین توالی
) گراف ها ، جانشینی C با T را نشان می دهد (