- فنل اشباع کالیبره شده ۲۵ میلی لیتر
- کلروفرم ۲۴ میلی لیتر
- ایزوآمیلک الکل ۱ میلی لیتر
حجم کل ۵۰ میلی لیتر
بخش سوم
۳-۳- روش انجام طرح:
۳-۳-۱- نوع مطالعه:
مطالعه از نوع توصیفی-مقطعی بوده است.
۳-۳-۲-جامعه مورد مطالعه:
باکتریهای مورد استفاده در این تحقیق مربوط به سال های ۱۳۸۷ تا ۱۳۸۹ می باشند.این نمونه های بالینی از بیماران مشکوک به عفونت با سالمونلا که به بیمارستان های شهر تهران از جمله بیمارستان بقیه الله (عج) ، مرکز طبی کودکان و برخی از آزمایشگاه های سطح شهر مراجعه کرده بودند،اخذ و مورد بررسی و مطالعه قرار گرفتند.
۳-۳-۳- جمع آوری اطلاعات:
در زمان پذیرش بیماران ،پرسشنامه ای مشتمل بر سوالات مربوط به زمان شروع علائم،جنس،آدرس محل سکونت بیمار و سایر اطلاعات تکمیل می گردید. هر بیمار با کد مخصوص مشخص گردیده و شماره پرونده آن ثبت می گردید، که با هماهنگی های به عمل آمده با مسئولین آزمایشگاه های میکروب شناسی مراکز یاد شده این اطلاعات اخذ می شد.
۳-۳-۴- انجام امور باکتریولوژیک:
الف) کشت، جداسازی و تعیین هویت ایزوله های سالمونلا
طبق روش استاندارد،نمونه های بالینی از جمله مدفوع، خون و غیره از بیماران مشکوک به عفونت با سالمونلا گرفته می شدند.
نمونه مدفوع بیماران بلافاصله پس از نمونه گیری به محیط کشت سلنیت F منتقل می گردید. نمونه ها به مدت حد اکثر ۶ ساعت در این محیط نگهداری می شدند.سپس به محیط های کشت انتخابی، مانند Salmonella-Shigella(SS) agar، بیسموت سولفیت آگار sulfite agar Bismuth و سایر محیط های کشت، انتقال یافته و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شدند.
نمونه های خون نیز ابتدا در biphasic(solid and liquid) medium کشت داده شده و سپس به محیط های انتخابی انتقال داده می شدند. در روز بعد کلونی های مشکوک به سالمونلا جدا سازی می شدند و سپس توسط تست های بیو شیمیایی استاندارد نظیر انتقال بر روی محیط ،Simmon citrate agar Triple sugar iron(TSI) ،اوره و MRVP brothمورد شناسایی قرار می گرفتند.
پس از انجام آزمون های بیوشیمیایی، جهت جداسازی و تایید سالمونلا، آزمون سرو تایپینگ جهت مشخص نمودن آنتی ژن های O وH با آنتی سرم اختصاصی مربوطه انجام گردید(Staten
Institut.Copenhagen. Denmark) Serumبدین ترتیب که پس از تهیه سو سپانسیون باکتری و مجاور کردن آن با آنتی سرم، در صورت مثبت بودن به مدت ۱ تا ۲ دقیقه آگلوتیناسیون بر روی اسلاید مشاهده گردید.
ب)استخراج ژنوم باکتریایی
پس از جداسازی و تعیین هویت ایزوله های باکتریایی، با بهره گرفتن از روش جوشاندن^[۱۰۲]، ژنوم باکتریایی استخراج گردید. ابتدا باکتری ها در محیط BHI براث( ۱۰ میلی لیتر) به مدت یک شبانه روز کشت داده شدند. سپس کدورت لوله های واجد کشت مایع با بهره گرفتن از اسپکتوفوتومتر در طول موج ۶۰۰ نانومتر خوانده شد. اگر OD برابر با چهار یا بیشتر باشد، تعداد باکتری های موجود در لوله برای استخراج مناسب خواهد بود.

سپس محیط های کشت به میکروتیوب های دو میلی لیتری انتقال یافت و به مدت ده دقیقه در دور ۹۰۰۰ دور سانتریفوژ گردید تا رسوب باکتری بدست آید. پس از حذف مایع رویی، ۴۰۰ میکرولیتر آب مقطر دیونیزه به رسوب باکتریایی اضافه گردید سپس سوسپانسیون حاصل، ۱۵ دقیقه در دمای ۱۰۰ درجه سانتی گراد جوشانده شد. میکروتیوب دوباره به مدت ۱۰ دقیقه در دور ۶۰۰۰ دور، سانتریفوژ شدند و ۱۰۰ میکرولیتر از مایع رویی( به عنوان ژنوم استخراج شده) با بهره گرفتن از سمپلر جمع و در یک میکروتیوب جدید جمع آوری گردید.
ج) اندازه گیری مقدار DNA استخراج شده
این عمل به کمک دستگاه اسپکتوفوتومتر( نانودراب) در طول موج های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر به ترتیب برای بررسی میزان جذب DNA و پروتئین ها وتعیین میزان خلوص DNA انجام می گردید. این عمل به اینصورت انجام می شود که ابتدا بوسیله دو میکرولیتر آب مقطر دیونیزه دستگاه را بلانک کرده و سپس از نمونه خود دو میکرولیتر برداشته و OD 260 به ۲۸۰ نانومتر را می سنجیم.
بخش چهارم: آزمایش های مولکولی
۳-۴- ژنوتایپینگ ایزوله های سالمونلا با بهره گرفتن از روش MLVA
۳-۴-۱- انجام آزمایش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR
برای تیپ بندی ژنتیکی ایزوله های سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس با بهره گرفتن از تکنیک MLVA، از ۸ لوکوس VNTR مختلف استفاده شد. پرایمر های که برای انجام PCR استفاده شد، از سه مقاله مختلف انتخاب گردید(۳۶, ۴۰, ۴۳).
ویژگی این پرایمر ها آن بود که به تعیین توالی^[۱۰۳] نیازی نداشت.این لوکوس های VNTR، هم از نظر اندازه و هم از نظر تعداد تکرار مناسب بودند. به عبارت دیگر، اندازه ی تکرار آن ها به قدری بود که با استفاده الکتروفورز بر روی ژل آگارز، کاملا از یکدیگر تفکیک می شدند. نام لوکوس ها و پرایمر های انتخابی در جدول ۳-۱ نمایش داده شده است. این پرایمر ها پس از انجام بلاست^[۱۰۴]، از شرکت ماکروژن^[۱۰۵] کره جنوبی سفارش داده شدند.
جدول ۳-۱، نام لوکوس ها و پرایمر های اختصاصی