۰

۰

۰

۰

۰

۰

۰

۰

۰

۰

۰

۰

NAA

ج
ب
الف
تصویر ۲-۳ الف- برش برگ‌ها، ب- قرار دادن برگ‌ها در آنتی اکسیدانت، ج- برش ابتدایی و انتهایی برگ‌ها
۳-۵-۳ آزمایش سوم: بررسی تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد ۲,۴-D، TDZ و BAP بر جنین‌زایی سوماتیکی بساک خرما در محیط کشت MS
بدین منظور آزمایش در قالب فاکتوریل سه عاملی (جدول ۱-۳) با سه تکرار انجام شد. گل‌های نر خرما ناشناس در مرحله تک هسته‌ای جدا شدند (تصویر ۳-۳ الف). در این مرحله ‌گل‌های نر با پوشینه‌ی قهوه‌ای رنگ احاطه شده بودند (تصویر ۳-۳ ب). گل‌های نر برداشت شده را در دستمال کاغذی مرطوب پیچیده و سپس در فویل آلومینیومی قرار داده شدند (تصویر ۳-۳ ج) و در یخچال در دمای C˚۴ برای ۷- ۱ روز نگهداری شدند. مرحله‌ی نموی میکروسپور‌ در بساک‌های نارس با رنگ‌آمیزی سیتولوژیکی مشخص شد. بساک‌ها نخست با محلول استوکارمن (یک گرم پودر کارمن در محلول ۵۰ درصد اسید استیک مطلق در حال جوش حل سپس فیلتر شده و در تاریکی نگهداری می‌شوند) رنگ‌آمیزی شده و سپس مرحله‌ی نموی میکروسپور مشخص گردید (تصویر ۳-۳ د). تعدادی خوشه‌‌ از محور اصلی جدا شده و خوشه‌ها به قطعاتی شامل ۱۰-۷ گلچه برش داده شدند (تصویر ۳-۳ و). سپس‌گلچه‌ها در آب مقطر قرار داده و به زیر هود لامینار منتقل شدند. گل‌های برداشت شده پیش از اینکه باز شوند به طور سطحی استریل شدند. استریل کردن باید به گونه‌ای باشد که بساک کمتر تحت تأثیر ماده‌ی ضد‌عفونی کننده قرار گیرد. اسپری الکل اتانول به مدت چند دقیقه صورت گرفت و گلچه‌ها را به مدت ۱۵ دقیقه در هیپو‌کلرید‌سدیم ۲۵/۵ قرار داده شد. سپس سه بار با آب مقطر اتوکلاو شده شستشو داده شدند. هر خوشه‌چه از محوراصلی جدا شده و در پتری‌دیش قرار گرفت انتهای خوشه‌چه‌ها برش داده شده و کاسبرگ و گلبرگ‌ها از آن جدا ‌گردیدند. سپس بساک‌های جدا شده در پتری‌دیش‌ حاوی ۲۵ میلی ‌لیتر محیط کشت قرار گرفت (تصویر ۳-۳ ه). پتری‌ها را پارافیلم بسته و در دمای C˚ ۲۵ اتاق رشد و در تاریکی قرار داده شدند. محیط MS نیمه جامد با ۹۰ گرم در لیتر ساکارز، زغال فعال ۱ گرم در لیتر ۸/۵pH= تهیه شد.

د
و
ه
ج
ب
الف
تصویر ۳-۳ الف- اسپات گل آذین نر، ب- گل آذین باز شده از پوشینه، ج- پوشانیدن اسپات گل نر در فویل آلومینیومی، د- خوشه‌های برش شده به قطعاتی حاوی چند گلچه، ه- کشت بساک‌ها در محیط کشت، و- مرحله‌ی ‌نموی میکروسپور‌ها
۴-۵-۳ آزمایش چهارم: بررسی تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد ۲,۴-D، TDZ و BAP بر جنین‌زایی سوماتیکی ریزنمونه بساک خرما در محیط کشت Y3 مایع
آزمایش در قالب طرح کرت‌های خردشده که فاکتور اصلی ۷ روز‌ مختلف کشت و فاکتور فرعی ترکیبات تیماری تنظیم کننده‌های رشد با ۲۰ سطح (جدول ۱-۳) صورت گرفت. بعد از تهیه گل نر ناشناس و ضدعفونی گلچه‌ها، هر خوشه‌چه از محوراصلی (تصویر ۴-۳ الف) جدا شده و در پتری‌دیش قرار گرفت. انتهای خوشه‌چه‌ها برش داده شده و کاسبرگ و گلبرگ‌ها از آن جدا ‌گردیدند. سپس بساک‌های جدا شده در پتری‌دیش‌ حاوی ۲۵ میلی ‌لیتر محیط کشت (تراکم‌های مختلف ۱۵-۲۵) کاشته شد (تصویر ۴-۳ ب). پتری‌ها را با پارافیلم بسته و در دمای C˚۲۵ اتاق رشد و در تاریکی و بر روی شیکر با سرعت ۵۰ دور در دقیقه قرار داده شدند (تصویر ۴-۳ ج). گل‌های نر برداشت شده را در داخل پوشینه داخل دستمال کاغذی مرطوب پیچیده و سپس در فویل آلومینیومی قرار داده در یخچال در دمای C˚۴ برای ۷-۱ روز نگهداری می‌شود. کشت در ۷ روز متوالی در ۲۰ ترکیب تیماری مختلف اکسین و سیتوکینین صورت گرفت (جدول۱-۳). محیط کشت Y₃ مایع (پیوست ۲) با ۹۰ گرم در لیتر ساکارز و ۱ گرم در لیتر زغال فعال تهیه شد.

ج
ب
الف
تصویر ۴-۳ الف- خوشه‌چه همراه با محور گل نر خرما، ب- کشت بساک در محیط کشت مایع، ج- قرار دادن پتری‌ها بر روی شیکر
۵-۵-۳ آزمایش پنجم: بررسی تأثیر غلظت ساکارز بر کشت بساک خرما
بدین منظور آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. بعد از تهیه گل نر ناشناس (تصویر ۵-۳ الف) و ضد‌عفونی، بساک‌های جدا شده (تصویر ۵-۳ ب) در پتری‌دیش‌ حاوی ۲۵ میلی ‌لیتر محیط کشت (تراکم‌های مختلف ۱۵-۲۵) کاشته شد (تصویر ۵-۳ ج). پتری‌ها را پارافیلم بسته و در دمای ۲۵ درجه اتاق رشد و در تاریکی بر روی شیکر با سرعت ۵۰ دور در دقیقه قرار داده شدند.
محیط کشت Y₃ (پیوست ۲) با غلظت‌های مختلف ۳۰–۶۰-۹۰-۱۲۰ گرم در لیتر ساکارز و زغال فعال ۱ گرم در لیتر و ۸/۵ pH= تهیه شد.

ب
الف
ج
تصویر ۵-۳ الف- خوشه‌چه‌های نر خرما، ب- بساک گل نر، ج- قرار دادن بساک‌ها در محیط کشت
۶-۵-۳ آزمایش ششم: بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف کلشی‌سین بر روی کشت بساک خرما
بدین منظور آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. گل‌های نر خرما در مرحله تک هسته‌ای انتهایی از نخل‌های نر جدا شدند. پس از جدا کردن گل‌ها، به مدت یک روز در دمای C˚۸ قرار گرفتند. پس از طی این مدت، گل‌ها در زیر هود لامینار ضد عفونی شدند و بساک‌ها جدا گردید. غلظت‌های مختلف ۱۲۵، ۲۵۰، ۵۰۰، ۱۰۰۰ میلی‌گرم در لیتر کلشی‌سین تهیه‌ شدند، بساک‌های تحت تیمار کلشی‌سین در دمای C˚۲۵ در تاریکی بر روی شیکر با سرعت۵۰ دور در دقیقه قرار در زمان‌های مختلف ۱۲- ۲۴- ۳۶- ۴۸ ساعت گرفتند. بعد از اعمال مقادیر مختلف کلشی‌سین در مدت زمان مشخص بساک‌ها به محیط کشت Y₃ نیمه جامد به همراه زغال فعال با میزان ۱ گرم در لیتر و ۹۰ گرم در لیتر ساکارز با سه تکرار برای هر غلظت و مدت زمان کشت صورت گرفت. در هر پتری‌دیش حدود ۲۵ عدد بساک قرار داده و با پارافیلم بسته شده و در اتاق رشد در دمای C˚ ۲۵ در تاریکی قرار داده شدند. بساک‌های کاشته شده بعد از ۶ هفته واکشت شده و واکنش آنها از جمله کالوس‌دهی مورد بررسی قرار گرفت.
۷-۵-۳ آزمایش هفتم: کشت میکروسپور
برای تحقق این هدف جدا‌سازی گل‌های نر از غلاف و برش به قطعاتی متشکل از ۵ تا ۷ گلچه صورت گرفته ضدعفونی انجام گرفت و سپس در زیر هود لامینار بساک‌ها جدا گردیدند. در هاون چینی از محیط کشت ایزولاسیون ریخته و حدود ۳۰ گلچه را قرار داده و سپس شروع به له کردن و سائیدن گلچه‌ها گردید و در عین حال باید توجه داشت که از اعمال فشار زیاد بر روی گلچه‌ها خود‌داری کرد چون سبب از بین رفتن میکروسپور‌ها می‌شود. محلول به‌دست آمده را از مش با منفذ µm 40 (تصویر ۶-۳ الف) عبور داده و محیط همراه با میکروسپور‌ها را در یک فالکون اتوکلاو شده ریخته و سانترفیوژ به مدت ۲ دقیقه و با سرعت ۱۵۰۰ دور در دقیقه انجام شد، بعد از طی این مدت زمان میکروسپور‌ها رسوب کرده (تصویر ۶-۳ ب) و مایع رویی دور ریخته شد، جهت خلوص بیشتر میکروسپور‌ها یک بار دیگر سانترفیوژ صورت گرفت. حدود ۳۰ میلی ‌لیتر از محیط کشت را به میکروسپور‌ها اضافه گردید، با پیست اتوکلاو شده حدود ۱۰ میلی لیتر را بر‌داشته و در پلیت ریخته و درب آن با پارافیلم بسته شده، در تاریکی بر روی شیکر با سرعت ۵۰ دور در دقیقه در اتاق رشد قرار داده شد. جهت تعیین تراکم میکروسپور‌ها از لام هموسایتومتری استفاده شد (تصویر ۳-۶ ج).