گام ۳. یافتن مجموعه بهینه­ ای از پارامتر­هایی که حداکثر یا حداقل مقدار پاسخ را تولید کند.
گام ۴. بررسی اثرات مستقیم و متقابل پارامتر­های فرایند از طریق جدول تجزیه و تحلیل واریانس (ANOVA).
با توجه به نتایج آزمون­های Single-factor، سه عامل مهم و موثر بر راندمان استخراج پلی­ساکارید (دمای استخراج، زمان استخراج و نسبت آب به ماده خام) مورد تائید قرار گرفت (لی و همکاران، ۲۰۱۳). سپس بر اساس طرح Box-Behnken، سه متغیر در سه سطح (پراکاش مران ^[۱۴۷]و همکاران، ۲۰۱۳؛ سانتوس^[۱۴۸] و همکاران، ۲۰۱۳) برای بهینه­سازی راندمان استخراج پلی­ساکارید، مطابق جدول ۴-۱ به کار گرفته شد:

جدول ۴-۱ متغیر­های مورد بررسی بر راندمان استخراج پلی­ساکارید و سطوح آن­ها، بر اساس طرح Box-Behnken

سه متغیر مستقل (X₁ : دمای استخراج ؛ X₂ : زمان استخراج و X₃ : نسبت آب به ماده خام) در سه سطح فوق به اجرا در­آمدند. مقادیر پارامتر­­های استخراج توسط معادله ۴-۱ مشخص شدند، که در آن X_i نشان دهنده متغیر، x_i : ارزش واقعی، x₀ : ارزش واقعی متغیر مستقل در نقطه مرکزی و xΔ : میزان تغییر متغیر است.
معادله ۴-۱ (لی و همکاران، ۲۰۱۳)
روش پاسخ سطح (RSM) یک مدل غیر خطی درجه ۲ به صورتی که در معادله ۴-۲ آمده است، معرفی کرد.

معادله ۴-۲ (لی و همکاران، ۲۰۱۳)
در این معادله Y پاسخ پیش ­بینی شده، X_i و X_j متغیر­های مستقل و _۰β، _iβ ، _iiβ و _ijβ به ترتیب نشان دهنده ضرایب رگرسیون برای عرض از مبدا (intercept)، ضرایب خطی، درجه دوم و اثر متقابل می­باشند.
جدول ۴-۲ نتایج به دست آمده برای راندمان استخراج پلی­ساکارید بر اساس طرح Box-Behnken برای سه متغیر

بر این اساس، با بهره گرفتن از طرح آماری Box-Behnken ، ۱۷ تیمار با شرایط مندرج در جدول ۴-۲ تعریف شده و به اجرا در آمد که نتایج آن در جدول مذکور مشاهده می­ شود. مطابق اطلاعات جدول ۴-۲ کمترین درصد راندمان به دست آمده مربوط به تیمار ۳ (۲۴/۱۲ %) و بیشترین میزان به دست آمده مربوط به تیمار ۱۱ (۷۷/۱۴ %) می­باشد.
آنالیز واریانس (ANOVA) مدل به صورتی که در جدول ۴-۳ آورده شده انجام شد. P-value به عنوان معیاری برای بررسی اهمیت متغیر­ها مورد استفاده قرار گرفت. مقادیر کمتر از P-value نشان دهنده اهمیت (تاثیرگذاری) بیشتر متغیر مربوطه است (گوا^[۱۴۹] و همکاران، ۲۰۱۰). بر اساس این مدل، اثر خطی دمای استخراج (X₁) و زمان استخراج (X₂) تأثیر بسیار زیادی بر راندمان داشتند (۰۰۰۱/۰P < ) و از این میان، اثر خطی دمای استخراج (X₁) به دلیل داشتن مجموع مربعات بالاتر (۲۳/۲) بیشترین اثر را بر راندمان استخراج پلی­ساکارید اعمال کرد. همچنین اثر خطی متغیر نسبت آب به ماده خام (X₃)، اثر متقابل زمان و نسبت آب به ماده خام (X₂X₃) و اثر درجه دوم دمای استخراج (X₁²)، در سطح ۹۵ % (۰۵/۰P <) معنی­دار شدند. این در حالی است که اثر متقابل دما و زمان (X₁X₂)، متقابل دما و نسبت آب به ماده خام (X₁X₂)، درجه دوم زمان (X₂²) و اثر درجه دوم نسبت آب به ماده خام (X₃²) معنی دار نبود (۰۵/۰P >)، یعنی تاثیر قابل توجهی بر عملکرد استخراج پلی­ساکارید نخواهند داشت.
۴-۳ تجزیه و تحلیل واریانس و بررسی کفایت مدل رگرسیون
تجزیه و تحلیل واریانس به منظور بررسی کیفیت مدل رگرسیونی برازش شده و پارامتر­های آن، استفاده می­ شود. جهت به دست آوردن مدل برای پیش ­بینی پاسخ (راندمان استخراج)، رابطه­ های خطی و چند جمله­ای درجه دوم بر داده ­های به دست آمده از آزمون­ها برازش شدند. سپس این مدل­ها مورد آنالیز آماری قرار گرفتند تا مدل مناسب گزینش گردد. برای ارزیابی کفایت مدل، تکنیک­های مختلفی وجود دارد. از این تکنیک­ها می­توان به بررسی مقدار باقی­مانده، مجموع مربع­های خطای پیش ­بینی شده (PRESS) و آزمون ضعف برازش^[۱۵۰] و F-value اشاره نمود. بر این اساس می­توان گفت از آن­جا که احتمال F مربوط به مدل، ۶۲/۴۴ است، نشان دهنده مناسب بودن مدل رگرسیون درجه دوم می­باشد. مقدار ۰۰۰۱/۰> P مربوط به مدل نیز بیانگر معنادار بودن مدل برازش شده است. فاکتور ضعف برازش نشان دهنده نقص داده ­های آزمایشی برای یک مدل می­باشد که در آن نقاط مدل نمی­تواند خطای تصادفی داده ­های آزمایشی را محاسبه کند. اگر فاکتور ضعف برازش معنی­دار باشد پاسخ­ها با احتمال ضعیفی توسط مدل پیش ­بینی می­ شود، لذا این آزمون نباید معنی­دار باشد. آزمون ضعف برازش در این پژوهش، به علت دارا بودن ۰۵/۰P > نسبت به خطای خالص معنی­دار نبود. ضریب تعیین (R²) به عنوان نسبت تغییرات توصیف شده توسط مدل به تغییرات کل بیان می­ شود که معیاری از درجه تناسب برازش می­باشد و هر چه به یک نزدیک­تر شود قدرت مدل برازش یافته در توصیف تغییرات پاسخ به عنوان تابعی از متغیر­های مستقل بیشتر می­ شود. برای یک مدل با برازش خوب مقدار R² باید حداقل ۸/۰ باشد. در پژوهش حاضر R² برای راندمان استخراج ۹۷۲/۰ به دست آمد که بیانگر این است که مدل رگرسیون ارائه شده، واکنش را به خوبی توضیح داده و مدل برازش یافته توانسته ۲/۹۷ درصد از کل تغییرات در دامنه مقادیر مورد مطالعه را توضیح دهد. لازم به ذکر است، اضافه کردن یک متغیر به مدل همیشه باعث افزایش R² می­ شود (صرف­نظر از اینکه متغیر اضافه شده از نظر آماری معنی­دار باشد یا نباشد. به این ترتیب بالا بودن R² همیشه کفایت مدل را نشان نمی­دهد. به همین دلیل باید از فاکتور دیگری به نام ضریب تعیین تعدیل شده ( Adjusted - R²) نیز برای بررسی مناسب بودن مدل استفاده شود. بر خلاف R²، R² تعدیل شده تنها در صورتی افزایش می­یابد که شرایط جدید، مدل را بیش از حالتی که از نظر تصادفی مورد انتظار است بهبود بخشد. بالا بودن R²
جدول ۴-۳ آنالیز واریانس مدل سطح پاسخ درجه دوم برای متغیرها، و آنالیز آماری مدل برازش یافته برای داده ­های پاسخ