دوباره دما بهC˚ ۹۴ افزایش می‌یابد. مولکول‌های دو رشته‌ای DNA که هر یک شامل یکرشته از مولکول اولیه و یک رشته جدید DNA هستند، به رشته های منفرد و مجزا دناتوره می‌شوند. این روند منجر به چرخه دوم دناتوره شدن، اتصال پرایمر^۲ و ساخته شدن DNA خواهد شد که در انتهای آن، هشت رشته DNA به وجود خواهد آمد. با تکرار ۳۰ چرخه، مولکول دو رشته ای شروع واکنش، به بیش از ۱۳۰ میلیون مولکول دو رشته‌ای تبدیل می‌شود که هر کدام نسخه‌ای از یک توالی است که توسط دو محل اتصال پرایمر مشخص می‌شود (۷۹).
شکل ۱-۸ : مراحل واکنش PCR (79).
۱-۱۶-۲ طراحی پرایمر:
اولین و اساسی‌ترین قدم در تکثیر یک قطعه خاص DNA و انجام PCR، طراحی پرایمر است. جهت انجام این کار رعایت نکات زیر ضروری می‌باشد (۷۸).
طول پرایمرها باید بین ۲۰ تا ۲۵ نوکلئوتید باشد (در بعضی مواقع طول ۱۸ تا ۲۵ نیز کاربرد دارد) طول کمتر، اتصال پرایمر به توالی هدف را سست می‌کند و طول بیشتر، این اتصال را دشوار می‌سازد، که در هر دو مورد مقدار محصول شدیداً کاهش می‌یابد.
پرایمر‌های طراحی شده باید تنها یک قطعه DNAیی، یعنی همان توالی مورد نظر را تکثیر کنند و به هیچ بخش دیگری از کل DNAی ژنومی متصل نشوند.
دمای اتصال دو پرایمر باید نزدیک به هم باشد و تفاوت چندانی با هم نداشته باشند.
هر دو پرایمر از نظر درصد گوانین و سیتوزین باید در یک محدوده قرار داشته باشند.
پرایمرها باید از نظر درصد گوانین و سیتوزین در حد نرمال باشند، (بین ۴۰ تا ۶۰)، درصد بیشتر GC، شرایط PCR را دشوار می‌کند و درصد کمتر اتصال پرایمر به توالی هدف را سست و میزان محصول را کاهش می‌دهد.
پرایمرها نباید تشکیل ساختار سنجاق سری بدهند.
پرایمرها در دمای نزدیک به دمای اتصال، تشکیل دایمر با خودشان ندهند.
پرایمرها در دمای نزدیک به دمای اتصال، با یکدیگر تشکیل دایمر با همدیگر ندهند
در انتهای‌ َ۳ پرایمر باید حداقل یک C ‌یا G قرار گیرد.
پرایمر به‌ توالی‌ تکرار شونده‌ ختم‌ نشود.
۱-۱۶-۳ دمای اتصال پرایمر
دمای‌ اتصال‌ باید به قدر کافی‌ پایین‌ باشد تا پرایمر و DNA الگو قادر به‌ اتصال‌ باشند و از سوی دیگر باید به‌ قدر مناسب‌ بالا باشد تا از تشکیل‌ اتصالات‌ غیراختصاصی‌ جلوگیری‌ کند. دمای‌ اتصال از روی‌ شاخصی‌ به‌ نام‌ درجه‌ حرارت‌ ذوب ‌™ محاسبه‌ می‌شود. دمای‌ ذوب‌ درجه‌ حرارتی‌ است‌ که‌ درآن‌ نیمی‌ از DNAها به‌ صورت‌ تک‌ رشته‌ای‌ درآمده‌اند. یکی‌ از مهمترین‌ مشخصات Tm، وابستگی‌ آن‌ به‌ ترکیب‌ بازی DNA است. گوانین و سیتوزین سه‌ پیوند هیدروژنی‌ و آدنین‌ و تیمین‌ دو پیوند هیدروژنی‌ دارند، بنابراین‌ هر چقدر مقدار گوانین‌ و سیتوزین‌ در DNA بیشتر باشد Tm بیشتر است. دمای‌ ۲-۱ درجه‌ سانتی‌گراد کمتر از Tm کافیست‌ که‌ هیبریداسیون‌ بین‌ پرایمر وDNAی‌ الگو در آن‌ صورت‌ گیرد. دمای‌ ذوب‌ به طور معمول‌ از طریق‌ فرمول‌ ساده زیر نیز محاسبه‌ می‌شود (۷۸).

Tm = (4 × (G + C) + 2 × (A + T)) برای‌ هر پرایمر ۲۰ نوکلئوتیدی‌زنجیره پلی مراز
۱۷ الکتروفورز:
الکتروفورز دستگاهی است که بر اساس نیروی عبور جریان الکترون ها کار می کند به این صورت که با ایجاد یک میدان الکتریکی باعث حرکت اجسام دارای بار منفی به طرف قطب مثبت و اجسام دارای بار مثبت به طرف قطب منفی حرکت می کنند (۷۹).
DNA و RNA به دلیل یون های فسفات و هم چنین به دلیل اتصال ملکول های SDS به آن ها ، دارای بار منفی زیاد می باشند و به همین دلیل به طرف قطب مثبت حرکت می کنند. سرعت حرکت قطعات سبک تر از قطعات سنگین تر بیشتر است و به همین دلیل قطعات مختلف DNA از هم جدا می شوند و نوارهای مختلفی را تشکیل می دهند با بهره گرفتن از قطعات شاهد با وزن ملکولی مشخص می توان وزن ملکولی قطعات مجهول را پیدا کرد (۷۹).
شکل ۱-۹ : ژل الکتروفورز (۷۹).
۱-۱۸ روش آشکارسازی اسید نوکلئیک:
رنگ آمیزی به وسیلۀ اتیدیوم بروماید یک مادۀ چند حلقه ای خاص می باشد که قادر است به بازهای آلی متصل شود (از قسمت های NH2) این ماده به تنهایی فاقد خاصیت فلورسانس است ولی وقتی به بازهای آلی متصل می شود خاصیت فلورسانس پیدا می کند و در مقابل نور UV به رنگ نارنجی دیده می شود (۷۹).
۱-۱۹ یافتن جهش ها با روش PCR - SSCP:
در روش SSCP^[39]، قطعه ای از ژن مورد نظر که معمولا کمتر از ۲۵۰ جفت باز است ، به وسیله PCR تکثیر می شود. سپس محصول PCR را به حالت واسرشته روی ژل پلی آکریل آمید الکتروفورز می کنند. هنگامی که DNA تک رشته ای روی ژل حرکت می کند، حالت واسرشتگی DNA از بین رفته و DNA تک رشته ای با توجه به ترکیب بازی که دارد، شکل فضایی خاصی به دست می آورد. ایجاد تغییر یا جهش در توالی DNA باعث می شود که شکل فضایی DNA تک رشته ای تغییر پیدا کند. سرعت حرکت DNA تک رشته ای روی ژل بستگی به شکل فضایی آن دارد. از این رو، جهش های نقطه ای می توانند با عث تغییر در حرکت DNA شده و این ترتیب، با توجه به تغییر حرکت، به وجود جهش پی برده می شود. با این روش ۹۰ درصد جهش ها شناسایی می گردد. این روش به دلیل سهولت جهت غربالگری جهش‌ها کاربرد وسیعی دارد. البته شرایط الکتروفورز  باید در هر مورد بهینه گردد.
توانایی تشخیص تغییرات بازی به چندین عامل بستگی دارد که باعث بهینه شدن وضوح باندی می‌گردد (۸۰). این عوامل عبارتند از:
اندازه قطعه: کارایی تخمینی برای شناسایی تغییرات تک بازی در مورد قطعاتی با طول کمتر از ۳۵۰bpدر حدود ۹۵-۹۰ درصد است، اما با افزایش طول قطعه کارآیی کاهش می‌یابد .
دمای ژل: تفاوت در حرکت باندها به دلیل جهش نوکلئوتیدی در دمای بافری ۲۵ C˚ قابل مشاهده است. دمای بهینه بصورت تجربی تعیین می‌گردد.
افزاینده‌های ژل: در برخی موارد ۱۰-۵ درصد گلیسرول به ژل افزوده می‌گردد تا تفاوت در حرکت قطعات مشخص‌تر گردد. از آنجا که گلیسرول می‌تواند حرکت تک رشته‌هایDNA را در دمای پایین کند نماید، معمولا در ژل‌هایی استفاده می‌شود که در دمای نزدیک به دمای اتاق الکتروفورز می‌گردند.
نسبت پل عرضی: نسبت آکریل آمید به بیس آکریل آمید بیانگر درصد پل عرضی است. در ژل‌های SSCP  این نسبت بین ۲-۱ درصد است. غلظت آکریل آمید بسته به اندازه قطعه از ۵ تا ۱۲ درصد متغیر است.
غلظت بافری: ژل ها در بافرTBEبا غلظتX 5/0یا ۱Xالکتروفورز می‌گردند. در برخی موارد به نظر می‌رسد بافرX ۵/۰ نتیجه بهتری به همراه داشته باشد.
در برخی پروتکل‌های SSCPاز قطعات نشاندار شده با رادیو ایزوتوپ‌ها استفاده می‌شود اما در حال حاضر از روش‌های غیر رادیو اکتیو هم استفاده می‌شود که به آن SSCPسرد گویند (۷۹).
مواد مورد نیاز:
غلظت و نوع آکریل آمید مورد استفاده بر حسب نوع نمونه متفاوت است بنابراین محلول استوک ۴۰ درصد آکریل آمید/ بیس اکریل آمید باید تهیه گردد (۷۹) .
جدول ۱-۲ : مواد لازم جهت تهیه ژلSSCP با درصدهای مختلف (۷۹).
شکل ۱-۱۰ : روش SSCP (79).
۱-۲۰ تعیین توالی بازهای DNA:
امروزه سه روش مختلف که در اصول با هم مشترک اند، برای تعیین توالی بازهای DNA وجود دارد (۹۷):
روش ماکسام – گیلبرت
روش سانجر
روش اتومات
الف : روش اتومات
روش های ماکسام – گیلبرت و سانجر برای تعیین توالی DNA مشکل، ظریف و وقت گیر است. با این روش ها قطعاتی با حداکثر چند صد نوکلئوتید را می توان تعیین توالی کرد. این روش ها به هیچ وجه برای تعیین توالی های عظیمی مانند تعیین توالی ژنوم انسان و یا حتی یک سلول مخمر مناسب نمی باشد.
مانند دیگر رشته های علوم، کامپیوتر وارد عرصه ی زیست ملکولی نیز شده است. در این زمینه روش اتومات یکی از دستاوردهای نوین علوم کامپیوتری برای زیست شناسی است. اساس این روش همان روش سانجر است.
ب : روش سانجر
این روش بر اساس استفاده از دی دزوکسی ریبوز بنا شده است. برای اضافه شدن نوکئوتیدها به زنجیره پلی نوکئوتیدی DNA وجود عامل – OH بر روی کربن شماره ۳َ قند دزوکسی ریبوز ضروری است. حال اگر این عامل – OH با یک هیدروژن جایگزین شود، نوکلئوتیدهای بعدی نمی توانند به این قند متصل شوند. در روش سانجر از قطعه ی DNA پلی مراز I استفاده می شود که خاصیت پلی مرازی دارد. این قطعه­ی کلینو در محیط حاوی نوکلئوتیدهای فعال و یک رشته الگو قادر به ساخت رشته مکمل می باشد. حال اگر در محیط دی دزوکسی نوکلئوتید وجود داشته باشد وارد زنجیره اصلی می شود و پس از آن نوکلئوتید دیگری نمی تواند به زنجیره­ی در حال ساخت اضافه شود، به همین دلیل همانند سازی به پایان می رسد و در نتیجه قطعه­ای حاصل خواهد شد که نمایانگر باز انتهایی است. در این روش احتیاج به پرایمر است تا بازها به این پرایمر متصل شوند. برای شروع کار، از چها لوله استفاده کرده که در هر کدام مقداری از قطعه­یDNA مورد نظر برای تعیین توالی، مقداری پرایمر و مقداری قطعه­ی کلینو DNA پلی مراز I و مقادیر مساوی از چهار نوکلئوتید dTTP وdCTP وdATP وdGTP اضافه می کنند. تنها تفاوت روش اتومات این است که از چهار نوع پرایمر که به چهار گروه فلورسانت مختلف متصل است استفاده می شود. پس از الکتروفورز، ژل را در دستگاه اسپکتروفتومتر اتوماتیک متصل به کامپیوتر قرار می دهند، دستگاه اسپکتروفتومتر رنگ فلورسانس را تعیین و به کامپیوتر گزارش می دهد و کامپیوتر با تفسیر رنگ حاصل از اسپکتروفتومتر توالی مورد نظر را تعیین می کند.
۱-۲۱ مروری بر مطالعات گذشته:
Srivastavaو همکارانش در سال ۲۰۱۲ در ۴۰۰ نمونه دارای فشارخون بالا و ۴۰۰ نمونه سالم، دو جهش با استفاده تکنیک PCR-RFLP)) یافتند. جهش اول یک جهش Misense در موقعیت حساس AGT T174M در اگزون ۲ که C بهT تبدیل شده بود. که اسیدآمینه ترونین با متیونین جایگزین شده بود و جهش دیگر جهش non-sense در موقعیت Glu53stop در ژن AGT بود (۴۵).
Dzielinska و همکارانش در سال ۲۰۱۱ پلی مورفیسمی در موقعیت M235T را مشخص کردند (۴۶).
Balam-ortiz و همکارانش در سال ۲۰۱۱ با مطالعه بر روی ۱۴۹ نمونه، ارتباط افزایش فشارخون در جمعیت سفید پوستان را با پلی مورفیسم T174M و افزایش سطوح AGT پلاسمایی، را مشخص کردند (۴۷).
Sarah S و همکارانش در سال ۲۰۱۰ پلی مورفیسمی در موقعیت AGTM235T در تعداد ۲۱۹۵ تعیین کرده و نشان دادند که ژنوتیپ TT ممکن است خطرافزایش فشارخون را در پی داشته باشد (۶۰).
Guerra و همکارانش در سال ۲۰۰۹ با بررسی بر روی ۴۳۶ نمونه از ۵ بیمارستان برای مدت یک سال، پلی مورفیسم AGTM235T با سطوح بالای آنژیوتانسینوژن سرمی و فشارخون بالا و اختلال قلبی در ارتباط بود (۶۱).
nova D و همکارانش در سال ۲۰۱۰ ارتباط بین پلی مورفیسم AGTM235T و هایپرتروفی بطن چپ در ۱۴۸ نمونه با فشارخون بالا را مشخص کردند (۴۸).